Artykuły zamieszczone w czasopiśmie medycznym Medycyna Rodzinna 3/2007 i 4/2007
Termin „adiuwant” pochodzi od łacińskiego słowa adjuvare – pomagać, i jest używany do określania każdej substancji, która może zwiększać humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną na antygen. Adiuwanty były używane do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na antygen od ponad 60 lat, zarówno w badaniach doświadczalnych, jak i w rutynowo stosowanych szczepionkach. Pionierem w tej dziedzinie badań był Ramon, który w latach 20-tych ubiegłego stulecia wykazał, że dodanie do szczepionek tężcowej i błoniczej substancji takich jak agar, tapioka, lecytyna, olej krochmalowy, saponiny czy nawet okruchy chleba, powoduje wzrost miana antytoksyn tężcowych i błoniczych. Mniej więcej w tym samym czasie Glenny i współ. odkryli działanie adiuwancyjne związków glinu i opisali zastosowanie ich w szczepionkach przeciw błonicy. Od tej pory sole glinu stały się powszechnie używanym adiuwantem w różnych szczepionkach.
Adiuwanty spowalniają uwalnianie antygenu z miejsca podania, indukują powstanie miejscowej reakcji zapalnej, ułatwiają prezentację antygenu w kontekście MHC klasy II, aktywują dopełniacz i komórki układu immunologicznego (limfocyty T i B, makrofagi) [9]. Adiuwanty nie mogą powodować zmiany składu chemicznego antygenu [10], wykazywać właściwości antygenowych i stymulować swoistej reakcji immunologicznej [9].
Różne właściwości fizyko-chemiczne różnych adiuwantów mogą powodować wzrost efektywności szczepień na wiele sposobów:
wywołują efekt dépôt polegający na zatrzymaniu antygenu w miejscu podania, hamując jego zbyt szybką eliminację z ustroju i stopniowo go uwalniając, dzięki czemu następuje zwiększenie i wydłużenie czasu jego interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APC) i limfocytami, powodując miejscowy odczyn zapalny,
posiadają zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez indukcję humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi,
zwiększają skuteczność działania słabych immunogenów, takich jak antygeny syntetyczne, wysoko oczyszczone lub rekombinowane,
poprawiają efektywność szczepienia i redukują związane z nim koszty, pozwalając na zmniejszenie dawki antygenu lub częstotliwości uodparniania,
działają immunostymulująco poprzez m.in. aktywację dopełniacza, wzmożenie syntezy cytokin (IL-1, IL-4, IL-6, IFN) czy selekcję odpowiedzi subpopulacji limfocytów T pomocniczych Th1 i/lub Th2,
zwiększają reaktywność komórek układu odpornościowego u niedojrzałych immunologicznie osobników, takich jak noworodki, u osób w podeszłym wieku lub o obniżonej odporności na skutek niektórych chorób lub radio- czy chemioterapii,
w szczepionkach złożonych pomagają przełamać współzawodnictwo pomiędzy antygenami.
Stosowanie adiuwantów umożliwia uzyskiwanie szybszej, silniejszej i dłużej trwającej odpowiedzi na antygen. Jednakże dotychczas poznane adiuwanty nie są obojętne dla organizmu człowieka. Mogą powodować ryzyko wystąpienia m.in.:
miejscowego ostrego lub przewlekłego odczynu zapalnego, bolesnego ropnia, guzka lub owrzodzenia,
autoimmunologicznego zapalenia stawów, skrobiawicy i zapalenia błony naczyniowej przedniej komory oka,
krzyżowych reakcji z antygenami człowieka doprowadzającymi do zapalenia kłębkowego nerek lub zapalenia opon mózgowych,
immunosupresji, uczulenia na tuberkulinę i inne antygeny podawane drogą transdermalną lub reakcji anafilaktycznych.
Generalnie, wybór odpowiednich adiuwantów szczepionkowych odzwierciedla kompromis pomiędzy wymogami adiuwancyjności, a akceptowalnie niskim poziomem niepożądanych reakcji organizmu.
Grzegorz ChodaczekZakład Terapii Doświadczalnej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda
http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=12214
Aleksandra Gołoś, Anna Lutyńska
ADIUWANTY GLINOWE W SZCZEPIONKACH – AKTUALNY STAN WIEDZY
"Związki glinu niekiedy mogą powodować reakcję
alergiczną. Do najczęściej obserwowanych działań
niepożądanych związanych z podaniem szczepionki
z adiuwantem glinowym należą łagodne, szybko przemijające
bolesne i swędzące guzki lub zaczerwienienie
w miejscu wstrzyknięcia (15).
Metaanaliza rejestrowanych niepożądanych odczynów
poszczepiennych po podaniu szczepionek przeciw
błonicy, tężcowi i krztuścowi adsorbowanych na solach
glinu nie wykazała poważnych i długotrwałych działań
niepożądanych (18). Dotychczas odnotowano zaledwie
kilka przypadków nadwrażliwości na glin w postaci
miejscowego lub układowego zapalenia skóry (19).
Doniesienia o potencjalnym wpływie ekspozycji
na glin pochodzący ze szczepionek na rozwój choroby
Alzheimera nie zostały udowodnione, tym bardziej że
poziom glinu adsorbowanego przez organizm z żywności
jest znacznie większy niż ten pochodzący ze
szczepionek (15). "
Zakład Badania Surowic i Szczepionek Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie
http://www.przeglepidemiol.pzh.gov.pl/adiuwanty-glinowe-w-szczepionkach-aktualny-stan-wiedzy?lang=pl
Jak działają adiuwanty? Jak działają szczepienia
http://www.who.int/immunization/documents/Elsevier_Vaccine_immunology.pdf
https://www.vaccines.gov/more_info/work/
Poniżej skrótowy poglądowa infografika z powyższej prezentacji
Rodzaje adiuwantów
Związki mineralne
Najpopularniejszym z adiuwantów używanych obecnie u ludzi są związki glinu, takie jak wodorotlenek glinu, siarczan glinu, fosforan glinu lub fosforan wapnia. W badaniach nad aktywnością immunostymulacyjną brano również pod uwagę sole takich metali jak azotan ceru, siarczan cynku, koloidalny wodorotlenek żelaza oraz chlorek wapnia, które zwiększały aktywność toksoidów błoniczych czy tężcowych, jednakże w porównaniu do soli glinu efekt ich działania był słabszy. Fosforan wapnia jako adiuwant był używany w szczepionkach skojarzonych: przeciw błonicy, tężcowi i krztuścowi (DTP) oraz w szczepionce przeciw DTP + polio, a także w szczepionkach monowalentnych przeciw błonicy, tężcowi, polio, BCG, żółtej febrze, różyczce, w szczepionkach przeciw wzw B i w preparatach alergenowych. Fosforan wapnia jest naturalnym składnikiem organizmu, w związku z tym jest dobrze tolerowany i łatwo resorbowany. Ponadto skutecznie wiąże się z antygenami i powoli je uwalnia oraz wywołuje wytworzenie wysokiego poziomu przeciwciał klasy IgG. Badania kliniczne wykazały skuteczność i bezpieczeństwo szczepionek zawierających adiuwant wapniowy.
Glinowe adiuwanty działają głównie przez tworzenie efektu dépôt, który pozwala na powolne uwalnianie antygenu, w ten sposób przedłużając czas interakcji pomiędzy antygenem a komórkami prezentującymi antygen (APC) i limfocytami. Wstrzyknięcie glinu i niezaadsorbowanego antygenu do organizmu doprowadza do powstania ogniska zapalnego, które z kolei przyciąga komórki immunokompetentne. Związki glinu aktywują również dopełniacz, co prowadzi do miejscowej odpowiedzi zapalnej i rozwoju komórek pamięci linii B. Adiuwanty glinowe zwiększają głównie odpowiedź humoralną i są mniej efektywne we wzbudzaniu odpowiedzi typu komórkowego. Są one szczególnie skutecznym adiuwantem dla toksoidów. Toksoidy błonicze i tężcowe adsorbowane na adiuwantach glinowych są bardziej immunogenne niż podawane osobno. Zaadsorbowany toksoid tężcowy stymuluje odporność szybciej, na wyższym poziomie oraz bardziej trwale niż sam toksoid, nawet po podaniu antytoksyny tężcowej. Preparaty glinu są powszechnie używanymi adiuwantami w szczepionkach przeciwko błonicy, teżcowi i krztuścowi. Wodorotlenek glinu jest również stosowany w szczepionkach przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A, kleszczowemu zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu, w szczepionkach przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B drugiej i trzeciej generacji oraz w szczepionce przeciw Haemophilus influenzae typu b skoniugowanej z białkami meningokokowymi. Przez wiele lat adiuwanty glinowe były używane z satysfakcjonującymi rezultatami w preparatach alergenowych do odczulania pacjentów z alergią. Pomimo że odnotowywano przypadki miejscowych reakcji niepożądanych po podaniu szczepionki lub ekstraktu alergenowego z adiuwantem glinowym, preparaty takie uważane są za stosunkowo bezpieczne i corocznie podaje się miliony dawek szczepionek je zawierających, większość z nich dzieciom i niemowlętom. Preparaty zawierające związki glinu nie mogą być liofilizowane, nie mogą także ulec przypadkowemu zamrożeniu, dlatego ich dystrybucja i sposób przechowywania wymagają przestrzegania i monitorowania ściśle określonych warunków.
Emulsje
Odrębną grupę adiuwantów stanowią emulsje olejowe. Są to mieszaniny oleju i wody z dodatkiem tenzydów, czyli substancji powierzchniowo czynnych stabilizujących obie fazy. Pierwsze doniesienia na ten temat sięgają początków XX wieku, kiedy to Le Moignic i Pinoy odkryli, że zawiesina zabitych bakterii Salmonelli typhimurium w emulsji olejowej spowodowała wzrost odpowiedzi immunologicznej. Emulsje olejowe jako adiuwanty nie cieszyły się większą uwagą dopóki w 1930 roku Freund nie zademonstrował, że nieżywe prątki Mycobacterium tuberculosis zawieszone w emulsji wodno-olejowej silnie wzmagają odpowiedź immunologiczną. Adiuwant ten, czyli kompletny adiuwant Freuda (FCA) jest jednym z silniejszych adiuwantów dotąd opisanych i jest stosowany w badaniach eksperymentalnych. Natomiast wodno-olejowa emulsja bez mykobakterii, znana jako niekompletny adiuwant Freuda (FIA) jest znacznie bezpieczniejsza i używana w wielu szczepionkach weterynaryjnych m.in. przeciwko wściekliźnie, nosówce psiej, grypie rzekomej czy chorobie Newcastle. Przez pewien czas FIA był stosowany również do wzmożenia odpowiedzi immunologicznej w szczepionkach stosowanych u ludzi, np. przeciwko grypie i poliomyelitis, jednakże wywoływał on miejscowe reakcje niepożądane, takie jak ziarniniaki czy ropnie jałowe.
Klasyczne formuły adiuwantów bazujące na oleju mineralnym i emulgatorze (Arlacel A – monooleinian mannitolu), mimo iż same nie są stosowane ze względu na zbyt dużą toksyczność i wywoływanie skutków ubocznych w organizmie człowieka, stanowią wyznacznik do którego przyrównywane są nowe systemy adiuwancyjne.
Adiuwancyjne działanie emulsji polega na usprawnieniu transportu antygenu do APC, a także jego aktywacji. Emulsje chronią również antygeny przed rozkładem enzymatycznym, a przez zmianę ładunku elektrycznego mogą zwiększać ich immunogenność. Jednakże rodzaj oleju nie jest bez znaczenia, gdyż to on decyduje o stopniu pobudzenia komórek immunokompetentnych. Oleje mineralne, np. olej parafinowy pozostają w miejscu iniekcji o wiele dłużej niż oleje metabolizowane w organizmie, jak skwalen czy olej arachidonowy, które jednak działają bardziej drażniąco na tkanki i przyczyniają się do powstania bardziej nasilonego odczynu zapalnego. Decydująca jest tutaj długość łańcucha węglowodorowego w resztach kwasów tłuszczowych. Im krótszy łańcuch, tym lepsze właściwości solubilizujące i większe działanie drażniące. W zależności od sposobu uwalniania antygenu można rozróżnić emulsje O/W („olej w wodzie”), W/O („woda w oleju”) oraz W/O/W („woda w oleju w wodzie”). W pierwszym przypadku fazą ciągłą jest woda a fazą zdyspergowaną olej, antygen jest natomiast zatrzymywany na dość krótko. Odwrotnie jest w emulsji W/O, a antygen jest tu zatrzymywany dłużej. W emulsjach wielokrotnych typu W/O/W antygen znajduje się w wewnętrznej oraz w zewnętrznej fazie wodnej, co pozwala na dwuetapowe uwalnianie antygenu. Pierwsza porcja jest dostępna natychmiast po podaniu, druga jest uwalniana później jako dawka przypominająca. Układ W/O/W jest bardzo niestabilny, stąd nieodzowne jest użycie odpowiedniego stabilizatora.
SAF
Adiuwantami należącymi również do grupy emulsji zasługującymi na uwagę są SAF i MF59. SAF jest to syntetyczny kompleks (Syntex adjuvant formulation) w formie emulsji O/W opartej na biodegradowalnych olejach skwalenu i detergencie Tween 80 (polioksymonooleinian sorbitanu). W jego skład wchodzi również kopolimer tlenku etylenu (POE) i tlenku propylenu (POP) o nazwie Pluronic L121oraz bufor fosforanowy o pH 7,4. Allison i Byars opisali wersję SAF-1, która zawiera jeszcze syntetyczną pochodną MDP (treonylo-muramylodipeptyd). SAF swoją aktywność immunostymulującą zawdzięcza przede wszystkim adiuwancyjnym właściwościom kopolimerów. Mają one bowiem zdolność do wiązania antygenów białkowych z zachowaniem natywnej formy epitopu. Wykazano, że na tę aktywność znacząco wpływa długość łańcuchów POP i POE, co jednocześnie powoduje wzrost poziomu przeciwciał. Ponadto, kopolimery powodują wzrost ekspresji antygenu przy udziale cząsteczek MHC klasy II na makrofagach, zwiększając przez to ich zdolność do prezentacji antygenu limfocytom T. Badania kliniczne szczepionek przeciwko takim infekcjom jak wirus małpiego zespołu nabytego niedoboru odporności (SAIDS), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus Epsteina-Barr (EBV) oraz wirus opryszczki zwykłej (HSV) zawierającymi SAF, przyniosły zachęcające rezultaty.
MF59
MF59 – mikropłynna emulsja O/W jest oparta na skwalenie, a detergentami stabilizującymi cały układ są Tween 80 oraz Span 85 (trioleinian sorbitanu). Formuła tego adiuwantu była badana u wielu gatunków zwierząt doświadczalnych indukując znaczący wzrost odpowiedzi immunologicznej na różne antygeny takie jak cytomegalowirus, wirus opryszczki, wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu B, a także antygeny wirusa grypy. Badania kliniczne kilku szczepionek zawierających adiuwant MF59 wykonane w różnych grupach wiekowych, zarówno u noworodków, jak i u osób w wieku starszym, wykazały wysoką immunogenność szczepionek i potwierdziły bezpieczeństwo tych preparatów. MF59 był pierwszym adiuwantem zarejestrowanym do stosowania u ludzi obok adiuwantów glinowych. Badania, którym poddano ponad milion ludzi w Europie, potwierdziły silną adiuwancyjną skuteczność MF59, w wyniku czego nastąpiła rejestracja szczepionki przeciw grypie z MF59.
AS02
W trakcie badań eksperymentalnych jest również emulsyjny system adiuwancyjny – AS02. Zawierająca MPL i QS-21 emulsja O/W, powoduje wzrost poziomu przeciwciał i znacząco uwydatnia odpowiedź Th1 i komórkową odpowiedź z udziałem cytotoksycznych limfocytów T. W przeprowadzonych badaniach nad użyciem AS02 w opracowywanej szczepionce przeciw malarii wykazano, że nowa formuła adiuwancyjna jest zdolna wywołać wysokie miano przeciwciał jednocześnie indukując silną odpowiedź komórkową, prowadząc w konsekwencji do ogólnej poprawy skuteczności preparatu. Jego dużą efektywność zaobserwowano też w szczepionce przeciw gruźlicy u świnek morskich. Badania kliniczne były prowadzone również w przypadku szczepionki przeciw wirusowi papilloma (HPV – wirus brodawczaka ludzkiego). AS02 stosowany był także w połączeniu z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) oraz z antygenem wirusa HIV.
Saponiny
Quil A
Saponiny są dobrze znane jako immunologiczne stymulatory, lecz ich przydatność jako adiuwanty szczepionkowe jest ograniczona ze względu na toksyczność.
Częściowo oczyszczona saponina, zwana Quil A, ekstrahowana jest z kory kwilaji (Quillaja saponaria Molina), drzewa rosnącego w Ameryce Południowej. Sponiny są roślinnymi glikozydami, zawierającymi steroidowe aglikony. Glikozydy te składają się z hydrofobowych trójterpentynowych policyklicznych pierścieni z dwoma łańcuchami hydrofilnymi, co umożliwia im tworzenie z białkami micelli. Dokładny mechanizm działania adiuwancyjnego Quil-u A nie został jeszcze poznany. Glikozydy umożliwiają najprawdopodobniej wniknięcie antygenu do cytosolu i jego prezentację przez cząsteczki MHC klasy I, indukując w ten sposób odpowiedź komórkową. Quil A jest szeroko stosowany w szczepionkach weterynaryjnych, np. w końskiej szczepionce przeciw grypie.
Saponiny odkryte w korzeniach krzyżownicy wirginijskiej (Polygala senega L.) wykazują podobną aktywność do Quil-u A. Wyizolowane od niej frakcje PS-1 i PS-2, podane razem z antygenem, stymulowały wytwarzanie swoistych przeciwciał u myszy i kur. Na modelu mysim zaobserwowano preferencyjny wzrost podklasy przeciwciał IgG2a, a profil wydzielania cytokin odpowiadał odpowiedzi Th1. Saponiny te są mniej toksyczne w porównaniu do Quil-u A.
QS-21
Po oczyszczeniu frakcji saponinowych otrzymano QS-21 (StimulonTM), który wykazuje w stosunku do nich większą aktywność przy obniżonej toksyczności. Rozpuszczalny w wodzie QS-21 może być stosowany z wodorotlenkiem glinu lub w bardziej złożonych formułach adiuwancyjnych (ISCOPREPTM). Adjuwant ten zwiększa immunogenność proteinowych, glikoproteinowych i polisacharydowych antygenów u psów i naczelnych. QS-21 pobudza m.in. komórki cytotoksyczne CD8+, powoduje syntezę przeciwciał IgG2a oraz IgG1. W trakcie badań klinicznych są różne szczepionki zawierające QS-21 m.in. szczepionka przeciwko wirusowi grypy, Herpes simplex, HIV-1, przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B czy malarii. QS-21 wykorzystywano również w wielu badaniach nad szczepionkami przeciw nowotworom typu czerniak, nowotworom odbytu i innym. Badania przeprowadzone na około 3000 ochotników nie wykazały znaczących efektów ubocznych. Prowadzone są również badania toksykologiczne, które mają określić przydatność QS-21 w szczepionkach przeznaczonych dla dzieci.
ISCOMs
Po raz pierwszy kompleks immunostymulujący ISCOMs jako nowy system nośnikowy antygenu opisano w 1984 roku przez Moreina i wsp. ISCOM jest strukturą przestrzenną o średnicy 30-40 nm, pustą w środku i ujemnie naładowaną. ISCOM składa się z Quil-u A, cholesterolu i fosfolipidu (fosfatydylocholina lub fosfatydyloetanolamina). Dodanie białka antygenu do tych struktur poprzez reakcję hydrofobową prowadzi do powstania kompleksu ISCOMs, którego optymalny układ występuje w stosunku molowym 1:1:1:1. Kompleksy ISCOMs indukują syntezę i uwalnianie IL-1 przez APC, a w zależności od dawki antygenu, zwiększają też u nich liczbę cząsteczek MHC klasy II na powierzchni błony komórkowej. Antygeny są również prezentowane na cząsteczkach MHC klasy I. Potraktowanie komórek dendrytycznych (DC) immunostymulującymi kompleksami ISCOMs powoduje wytwarzanie przez nie IFN-γ. ISCOMs indukuje również silną lokalną aktywację nieswoistych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej, angażując różnorodne komórki m.in. makrofagi, DC oraz limfocyty, które z kolei powodują wydzielanie licznych mediatorów zapalnych, jak IL-1, IL-6, IL-12, INF-γ. Jednakże spośród nich tylko IL-12 wydaje się być w głównej mierze odpowiedzialna za aktywność adiuwancyjną kompleksu ISCOMs. Immunogenne właściwości ISCOMs wykazano dla różnych antygenów otoczkowych wirusów, m.in. grypy, HCV, odry czy wścieklizny, a także dla antygenów nie wirusowych np. pierwotniaka Plasmodium falciparum. Kompleksy ISCOMs są obecnie powszechnie używane w szczepionkach weterynaryjnych. Od czasu odkrycia kompleksu ISCOM, wiele szczepionek zawierających ten adiuwant było testowanych na modelu zwierzęcym wykazując indukcję zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Pearse i Drane opisali adiuwant ISCOMATRIX, który jest zasadniczo taką samą strukturą jak ISCOM, ale bez towarzyszącego mu antygenu. Antygeny mogą być łączone z adiuwantem ISCOMATRIX co prowadzi do powstania struktur, które mogą zapewnić taką samą prezentację antygenu oraz właściwości immunomodulacyjne co ISCOM, ale z o wiele szerszym zastosowaniem, ze względu na nieograniczoną liczbę hydrofobowych białek błonowych. Różne szczepionki zawierające ISCOMATRIX były badane w doświadczeniach na zwierzętach, a ostatnio przeprowadzano również liczne badania kliniczne na ludziach, które wykazały, że adiuwant ISCOMATRIX jest bezpieczny i indukuje zarówno humoralną, jak i komórkową odpowiedź immunologiczną. Zdolność adiuwantu ISCOMATRIX do indukcji tych mechanizmów jest możliwa dzięki prezentacji antygenu przez oba szlaki MHC klasy I i klasy II, a także dzięki właściwościom immunostymulacyjnym saponin. Dodatkowo, adiuwant ISCOMATRIX jest łatwy w produkcji i może być w szerokim zakresie łączony z różnymi antygenami.
Adiuwanty – substancje stymulujące odpowiedź immunologiczną - część II
Adiuwanty określane są jako substancje, które zwiększają lub modulują odpowiedź immunologiczną przeciw antygenom. Idealny adiuwant powinien stymulować reakcję immunologiczną, być bezpieczny i nietoksyczny. Szczepionki nowej generacji zawierające antygeny produkowane metodami inżynierii genetycznej lub tylko fragmenty antygenów są mniej immunogenne w porównaniu do szczepionek tradycyjnych. Dlatego szczepionki te wymagają stosowania nowych sysytemów adiuwancyjnych. W dalszej części pracy wymieniono niektóre z nich.
Adiuwanty o pochodzeniu bakteryjnym
LPS
Główne mechanizmy obronne organizmu są kierowane przede wszystkim przeciw elementom ściany komórkowej drobnoustrojów. Związki te, obecne w krwiobiegu, są jednymi z najsilniejszych aktywatorów procesu zapalnego. Użyte z konkretnym antygenem, zwiększają odpowiedź immunologiczną na ten antygen, działając w ten sposób jak adiuwant. Najbardziej znanym produktem bakteryjnym mającym właściwości adiuwancyjne jest lipopolisacharyd (LPS) Mycobacterium spp., Corynebacterium parvum lub Corynebacterium granulosum oraz Bordetella pertussis. Lipopolisacharyd jest jednak zbyt toksyczny i pirogenny, aby mógł być wykorzystywany jako adiuwant w szczepionkach przeznaczonych dla ludzi. Nawet śladowe jego ilości wywołują w organizmie człowieka gorączkę. W ostatnich latach zaobserwowano jednak duży postęp w detoksyfikacji LPS. LPS jest amfipatyczną molekułą z trzema regionami: O-swoisty polisacharyd, rdzeń oligosacharydu i lipid A. Łańcuch polisacharydowy O-swoisty jest elementem o dużej zmienności strukturalnej i odpowiada za właściwości antygenowe LPS. Region lipidu A jest disacharydem zbudowanym z dwóch reszt glukozaminy, z dwoma grupami fosforanowymi i pięcioma lub sześcioma resztami kwasów tłuszczowych o długości 12-16 atomów węgla, przyłączonymi do cząsteczek cukrów. Wolny lipid A, który odpowiada za najwięcej biologicznych aktywności takich jak działania adiuwancyjne i toksyczność, jest tak samo aktywny jak LPS i odpowiada za masywne pobudzenie komórek układu odpornościowego. Na aktywność adiuwancyjną LPS dla polisacharydowych i białkowych antygenów mają wpływ komórki T, zwłaszcza supresorowe. LPS aktywuje także makrofagi oraz inne komórki wydzielające monokiny m.in. IL-1, która stymuluje dalej limfocyty. W celu zmniejszenia toksyczności lipidu A, poddano go łagodnej hydrolizie, w wyniku której traci on jedną grupę fosforanową. Ribi i wsp. przeprowadzili bardziej selektywną hydrolizę traktując monofosforylowy lipid A z dzikich mutantów Salmonelli minnesota R595 lub Salmonelli typhimurium 0,1 M HCl, co spowodowało odcięcie jednego łańcucha kwasu tłuszczowego, otrzymując w ten sposób nowy adiuwant - MPLTM.
MPLTM
MPL (monofosforylowy lipid A) zachowuje wiele cech wyjściowej molekuły, jakim jest lipid A, działa jednak gorączkotwórczo w o wiele mniejszym stopniu. Może być stosowany pojedynczo lub wchodzić w skład złożonej formuły adiuwancyjnej zawierającej odpowiedni nośnik w postaci emulsji olejowej czy liposomu, co uruchamia swoiste mechanizmy cytotoksyczne. MPLTM zawdzięcza swoją aktywność adiuwancyjną przede wszystkim zdolności do pobudzania APC do efektywniejszej prezentacji antygenu, w wyniku czego następuje wzrost ekspresji cząsteczek kostymulujących. Wykazano, że komórki dendrytyczne (DC) przemieszczają się w obrębie śledziony do strefy limfocytów T. Zaobserwowano również wydzielanie większych ilości IFN-ă przez DC w obecności tego adiuwantu. MPL wpływa immunostymulująco na odpowiedź humoralną i komórkową poprzez interferencję z antygenowo-swoistymi supresorowymi komórkami T. W obecności MPLTM limfocyty T, którym jest prezentowany swoisty antygen, eksponują na błonie komórkowej więcej ligandów białek CD40 (cząsteczek CD40L), przekazujących komórkom dendrytycznym sygnał do dojrzewania. Podczas immunizacji donosowej, MPLTM jest również skutecznym adiuwantem, ponieważ pobudza syntezę przeciwciał IgA w obrębie błon śluzowych, nie tylko w górnych drogach oddechowych. Zaobserwowano też podwyższony poziom IgG2a w surowicy. MPLTM okazał się skutecznym adiuwantem w eksperymentalnych szczepionkach przeciw malarii i przeciwnowotworowych zarówno u zwierząt, jak i u człowieka.
Połączenie MPL z solami glinu stanowi nowy system adiuwancyjny SBAS4 wykorzystywany do indukcji ochronnego poziomu przeciwciał anty-HBs w szczepionkach przeciw wzw B. W badaniach przy udziale 150 młodych dorosłych wykazano, że szczepionka z nowym systemem adiuwancyjnym SBAS4 jest bardziej immunogenna w porównaniu z grupą kontrolną, którą stanowiły osoby immunizowane szczepionką Engerix B zawierającą jako adiuwant wodorotlenek glinu. Ponadto wykazano, że SBAS4 ma korzystny wpływ na odpowiedź humoralną in vivo oraz na odpowiedź komórkową in vitro, a także że jest bezpieczny, dobrze tolerowany i może wywoływać szybszą ochronę przeciw infekcjom wirusem HBV.
CpG
W przeciwieństwie do DNA człowieka i innych kręgowców, DNA bakterii, owadów i pasożytów wielokomórkowych zawierają tzw. motywy CpG, czyli niemetylowane sekwencje dinukleotydowe. Są one rozpoznawane przez receptor TLR9, ze względu na obecność sekwencji dinukleotydów cytozyny-guaniny, umieszczonych w odpowiednim sąsiedztwie dwóch zasad purynowych od końca 5´ i dwóch pirymidynowych od końca 3´. Motywy CpG u bakterii występują z częstością 1/16 par zasad, podczas gdy u kręgowców 1/64 par zasad i u nich zazwyczaj cytozyna ma przyłączoną grupę metylową. Efektem związania CpG jest poliklonalna aktywacja i proliferacja limfocytów B, niezależnie od pomocy limfocytów T, co wiąże się z wytwarzaniem przeciwciał i czynników antyapoptotycznych. APC reagują na bakteryjne DNA lub syntetyczne oligodeoksynukleotydy (ODN) zawierające motywy CpG, zwiększonym wydzielaniem prozapalnych cytokin jak IFN- α/β/γ, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, TNF-α, GM-CSF i chemokin, wzrostem liczby cząsteczek kostymulujących oraz cząsteczek MHC klasy II na ich powierzchni, a także pobudzeniem komórek dendrytycznych. Uruchomiona zostaje także odpowiedź typu Th1 oraz cytotoksyczne komórki NK. Po podaniu CpG noworodkom, u których reakcje obronne organizmu od początku są zdominowane przez komórki Th2, CpG pozwalają wzbudzić odpowiedź Th1, dzięki czemu szybciej powstają mechanizmy odporności komórkowej. W przypadku chorób alergicznych, w których obserwowana jest nadmierna aktywacja limfocytów Th2, motywy CpG mogą przesunąć profil reakcji immunologicznych w kierunku odpowiedzi typu Th1. W konsekwencji wzrasta wytwarzanie przeciwciał IgG2a, a zmniejsza się synteza przeciwciał IgE, odpowiedzialnych za rozwój choroby. Prowadzone są badania nad wykorzystaniem ODN jako adiuwantów, zarówno w szczepionkach przeciwnowotworowych, jak również w szczepionkach terapeutycznych. Adsorbowanie CpG na związkach glinu powoduje dodatkowe zwiększenie jego aktywności.
Enterotoksyny
Bardzo silnymi immunogenami, zwłaszcza po podaniu na błony śluzowe, są toksyna cholery (CT), pochodząca z przecinkowca cholery (Vibrio cholerae) i niestabilna termicznie enterotoksyna z Escherichia coli (LT). Pod względem budowy toksyny te są białkami zbudowanymi z dwóch regionów, A i B, homologicznymi w 80%. Region B zawierający 5 identycznych nie-kowalencyjnie związanych monomerów, jest immunologicznie dominujący i nietoksyczny. Region A jest biologicznie aktywnym białkiem o aktywności enzymatycznej, mającym właściwości toksyczne. Aktywność adiuwancyjna toksyn w obrębie błon śluzowych polega na pobudzaniu syntezy swoistych przeciwciał IgA w odpowiedzi na jednocześnie podawany antygen. Odporność śluzówkowa ma duże znaczenie, ponieważ dla niektórych patogenów błony śluzowe są miejscem wnikania do organizmu. Wykazano, że toksyny CT i LT wpływają na APC, stymulując u nich ekspresję białek MHC klasy II, cząsteczek kostymulujących oraz receptorów dla chemokin (CCR7), jak również indukując wytwarzanie IL-1, która uruchamia odczyn zapalny. Zaobserwowano także zdolność enterotoksyny do działania adiuwancyjnego przy immunizacji drogą transdermalną. Plaster nasączony roztworem antygenu i CT lub LT, umieszczony na nieuszkodzonej skórze, indukuje odpowiedź humoralną (głównie typu Th2) i syntezę przeciwciał IgG i IgA w surowicy i błonach śluzowych w odpowiedzi na antygen szczepionkowy.
Dipeptyd muramylowy i jego pochodne
W wyniku poszukiwań alternatywnych, mniej toksycznych adiuwantów, wyizolowano ze ściany komórkowej bakterii z rodzaju Mycobacterium, dipeptyd muramylowy (MDP – N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina). MDP, podobnie jak martwe mykobakterie, jest pirogenny i również wywołuje niepożądane efekty uboczne, chociaż w mniejszym stopniu. Z tego względu nie został zaakceptowany do stosowania w immunizacji ludzi. Badania nad uzyskaniem syntetycznych analogów lub pochodnych MDP pozbawionych toksyczności doprowadziły do otrzymania wielu związków o adiuwancyjnych właściwościach. Takimi analogami są np. treonylo-MDP, w której alaninę zastąpiono treoniną, MDP-Lys(L18), adamantylo-desmuramylodipeptyd, murabutyd czy MTP-PE – tripeptydowe (dodatkowa alanina) połączenie z fosfatydyloetanoloaminą, nadające cząsteczce amfifilowy charakter. Działanie adiuwancyjne MDP polega na mobilizacji APC oraz ich aktywacji połączonej z wydzielaniem cytokin takich jak TNF-α, IL-1, IL-6, IFN- α, GM-CSF, a także na pobudzenu fagocytozy. MDP powoduje wzrost proliferacji limfocytów T, indukowanych mitogenami i sam przy tym jest mitogenem dla limfocytów B. MDP podany w roztworze soli fizjologicznej wywołuje głównie odpowiedź humoralną, zawarty natomiast w emulsji wodno-olejowej (W/O), pobudza dodatkowo również odpowiedź komórkową. Murabutyd, lipofilna pochodna, powoduje także wzrost ekspresji CD80, CD83, CD86 i CD40 oraz stymuluje produkcję cytokin TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 przez komórki dendrytyczne człowieka (DCs). Szczepionki przeciwwirusowe zawierające tę pochodną, skutecznie indukują powstawanie przeciwciał swoistych u ludzi. MTP-PE, fosforanowa pochodna MDP, również wykazuje wysoką przydatność jako adiuwant m.in. w eksperymentalnej szczepionce przeciwko wirusowi nabytego niedoboru odporności typu I (HIV-1) oraz w szczepionce przeciwko grypie. Stosunkowo nowym typem szczepionki zawierającej jako adiuwant pochodną MDP (B30-MDP), jest liposomalna, przeciwgrypowa szczepionka zawierająca antygeny grypy takie jak hemaglutynina i neuraminidaza (HANA). Preparat ten zwiększa poziom przeciwciał oraz komórkową odporność u myszy i świnek morskich.
Liposomy
Liposomy są tworami kulistymi zbudowanymi z podwójnej błony lipidowej, w obrębie której występują fosfolipidy, glikolipidy oraz cholesterol. Zależnie od metody ich przygotowywania, liposomy mogą stanowić struktury pojedyncze lub wielowarstwowe o wielkości od 20 nm do nawet 3 ěm. Antygeny wprowadzane do ich wewnętrznej fazy wodnej, adsorbowane na powierzchni błony lub bezpośrednio w niej osadzone, mogą stanowić rezerwuar pozwalający na ich kontrolowane uwalnianie. Liposomy mogą służyć również za system nośnikowy dla APC. Działania adiuwancyjne liposomów zależy ponadto od ładunku powierzchniowego, składu chemicznego i metody sporządzania, jego dostępność natomiast jest uwarunkowana m.in. liczbą warstw lipidowych. Adiuwanty takie jak LPS, lipid A lub MDP połączone z liposomami z rekombinowanym antygenem Plasmodium falciparum i zmieszane z glinem, intensywnie stymulowały wytwarzanie przeciwciał. Liposomy mogą być również użyte jako doustne adiuwanty i w porównaniu z doustnym podaniem samego antygenu przyczyniały się do znacznie wyższej odpowiedzi śluzówkowej. Wysokie koszty produkcji, związane m.in. z koniecznością indywidualizowania struktury liposomu dla różnych antygenów oraz niestabilnością przy przechowywaniu, stanowią negatywny aspekt stosowania tych substancji w szczepionkach. Są one jednak bardzo dobrze tolerowane, pobudzając przy tym oba typy odpowiedzi immunologicznej - humoralną i komórkową. Często razem z antygenem wprowadza się do nich substancje oddziałujące bezpośrednio na komórki układu immunologicznego, dzięki czemu zwiększa się immunogenność całej formuły. Preparat IRIV złożony z immunostymulujących rekonstytuowanych wirosomów grypy, zawiera liposomy zbudowane z fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy i cholanu sodu oraz zintegrowane z błoną lipidową glikoproteiny wirusa grypy: hemaglutyninę oraz neuraminidazę. Hemaglutynina odpowiada za wiązanie liposomu z APC i rozpoczęcie endocytozy, neuraminidaza natomiast, przy braku efektywnej fagocytozy, umożliwia oderwanie się od receptora zawierającego kwas neuraminowy.
Archaeosomy
Nową strategią wakcynologii są również szczepionki autoadiuwantowe (self-adjuvant) np. archaeosomy, które nie wymagają dodatkowych adiuwantów, by zwiększyć immunogenność zawartego w formule antygenu. Archaeosomy są to liposomy otrzymane ze spolaryzowanych lipidów eterowych wyizolowanych z Archaeobacteria. Charakteryzują się obecnością długich, nasyconych i rozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych o liczbie atomów węgla 20, 25, 40, połączonych z glicerolem wiązaniem eterowym. Taka struktura archaeosomów zapewnia im wysoką trwałość i stabilność fizyko-chemiczną oraz skuteczność, gdyż nie wymagają one dodatkowych adiuwantów, by zwiększyć immunogenność zawartego w formule antygenu. Dodatkowo, archaeosomy uwydatniają rekrutację oraz aktywację komórek APC in vivo w wyniku czego dostarczają antygen cząsteczkom MHC zarówno klasy I jak i klasy II w celu jego prezentacji, bez wywoływania widocznej reakcji zapalnej. W badaniach na modelu mysim podanie archaeosomów zawierających zamknięte antygeny wywołuje silną i długotrwałą odpowiedź przeciwciał antygenowo-swoistych. Ponadto, indukują one zarówno odpowiedź humoralną jak i komórkową. W badaniach nad wykorzystaniem archaeosomów w szczepionkach przeciw nowotworom wykazano, że mają one zdolność do wywoływania silnej odpowiedzi limfocytów T cytotoksycznych CD8+ na zawarty w nich antygen. Odpowiedź immunologiczna indukowana przez archaeosomy jest długotrwała i powoduje powstanie komórek pamięci. Wykazano, że immunizacja myszy szczepionkami opartymi na archaeosomach indukuje silną odporność przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom, oraz wykazuje profilaktyczną i terapeutyczną skuteczność przeciwko rozwojowi nowotworów. Intensywne badania przeprowadzone na modelu mysim sugerują, że archaesomy są bezpieczne i mogą być używane jako adiuwanty w szczepionkach.
Amfifilowe kopolimery blokowe
Amfifilowe kopolimery blokowe należą do substancji powierzchniowo czynnych, często używanych do stabilizowania emulsji. Pod względem chemicznym są to związki glikoli polioksyetylenopoliksypropylenowych, otrzymywanych w wyniku polimeryzacji tlenku propylenu i tlenku etylenu. Aktywność adiuwancyjna kopolimerów jest zróżnicowana i zależy od długości łańcuchów (bloków) polioksyetylenowych (POE) i polioksypropylenowych (POP), co znacząco wpływa na ich właściwości fizyko-chemiczne. Jako adiuwant mogą być użyte kopolimery o zawartości POE mniejszej niż 10%, ponieważ są one nierozpuszczalne w wodzie. Wraz ze wzrostem ilości grup POE maleje aktywność adiuwancyjna. Kopolimery zawierające 5% POE pobudzają zarówno komórki Th1, jak i Th2, gdy jednak udział POE wzrasta do poziomu 10%, równowaga zostaje przesunięta w kierunku odpowiedzi typu Th2.
Mikrosfery
Mikrosfery, jako nośniki dla antygenów, umożliwiają nie tylko efektywną prezentację antygenów komórkom systemu odpornościowego, lecz również wywołują efekt dépôt, gdyż można je zaprojektować tak, by rozpadały się po kilku tygodniach, miesiącach a nawet po roku. Związki te są polimerami poliestrowymi utworzonymi z biokompatybilnych i ulegających biodegradacji w organizmie człowieka homo- i/lub kopolimerów kwasu mlekowego (PLA) lub glikolowego (PLGA). Ich struktura to kuliste, monolityczne molekuły o średnicy 1-50 ěm, wewnątrz których można rozpuścić lub zawiesić antygen. Mikrosfery o rozmiarze 10 μm wprowadzone do organizmu, wchłaniane są przez APC, a antygen jest uwalniany wewnątrz komórki. Antygen może przechodzić do płynu zewnątrzkomórkowego, jeśli mikrocząsteczki mają powyżej 10 μm średnicy i hydrolizują w tkankach. Stosując mieszaninę mikrosfer o różnej wielkości i czasie połowicznego rozpadu można uzyskać uwalnianie pulsacyjne, dzięki czemu nie ma konieczności powtórnego szczepienia, aby utrzymać ochronny poziom przeciwciał. W zależności od wielkości mikrosfer, szczepionki w nich zawarte będą mogły być stosowane parenteralnie lub doustnie. Stwierdzono również, że mikrosfery o średnicy mniejszej niż 10 μm są skutecznym immunologicznie nośnikiem dla prezentacji antygenu w obrębie błon śluzowych.
Cytokiny
Podanie cytokin razem z antygenem, zamiast stymulacji ich wytwarzania odpowiednimi czynnikami, wydaje się najprostszym rozwiązaniem. Przetwarzanie antygenu i aktywacja APC możliwe jest wówczas na poziomie jednej i tej samej komórki. Istotne jest jednak odpowiednie dobranie dawki, ponieważ zbyt mała nie przyniesie pożądanego efektu, nadmiar może natomiast pociągnąć za sobą konsekwencje w postaci np. autoagresji lub immunosupresji. Spotęgowanie działania cytokin można osiągnąć przez zamknięcie ich w liposomach, co pozwala na zmniejszenie dawki antygenu, a także wydłuża czas eliminacji cytokin i ułatwia ich przechwycenie przez APC. Wykazano, że u osób w podeszłym wieku, u których skuteczność standardowych szczepień nie przekracza 50%, IL-2 zawarta w liposomach razem z białkami powierzchniowymi wirusa grypy, znacznie zwiększa poziom ochronnych przeciwciał. We wzbudzaniu swoistej odpowiedzi typu Th1 bierze udział IL-12, która skutecznie stymuluje reakcje cytotoksyczne w stosunku do prątków gruźlicy, a także pierwotniaków z rodzaju Leishmania. U noworodków, podana razem z antygenem przełamuje dominację odpowiedzi Th2, pobudza syntezę przeciwciał IgG2a, stymulując jednocześnie limfocyty B pamięci. Jednakże, w porównaniu z innymi cytokinami stosowanymi pojedynczo, najskuteczniejszym adiuwantem w indukcji odpowiedzi humoralnej i komórkowej okazał się czynnik wzrostowy komórek dendrytycznych i makrofagów, GM-CSF. Podawany razem z IL-12 i TNF-α wzmaga on aktywność komórek cytotoksycznych CD8+, hamując wydzielanie IL-4 i IL-10 oraz indukując wytwarzanie IFN-α. W pierwszych badaniach klinicznych nad szczepionką przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B z GM-CSF jako adiuwantem wykazano, że odpowiedź anty-HBs i uzyskanie ochronnego miana przeciwciał zależne jest od dawki, czasu oraz drogi podania GM-CSF.
Podsumowanie
Nowe generacje szczepionek, bazujące na rekombinowanych białkach czy skoniugowanych antygenach, wymagają użycia ulepszonych adiuwantów do wzbudzenia odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej ustroju, stąd konieczne jest poszukiwanie nowych formuł adiuwancyjnych. Dotychczas stosowane adiuwanty, bazujące na efekcie dépôt lub ułatwionym transporcie antygenu do APC, prawdopodobnie zostaną w przyszłości zastąpione adiuwantami o właściwościach immunomodulujących. Prowadzone są również badania mające na celu otrzymanie szczepionki, która indukowałaby w pełni kontrolowaną i możliwą do sterowania odpowiedź immunologiczną. Nadrzędnymi priorytetami są jednak w dalszym ciągu takie właściwości szczepionek, jak: nietoksyczność, skuteczność, stabilność, nieskomplikowany proces produkcyjny i łatwość przechowywania oraz oczywiście niskie koszty. Możliwości technik inżynierii genetycznej wydają się szansą na osiągnięcie tych założeń.
Autorzy: Aleksandra Krause, Paulina Górska, Janusz Ślusarczyk http://portal.bioslone.pl/szczepienia_dawniej_i_dzis
